Набор инструментов для сборки ДНК, позволяющий раскрыть потенциал CRISPR/Cas9 для метаболической инженерии.

Биология связи, том 6, Номер статьи: 858 (2023) Цитировать эту статью

4891 Доступов

10 Альтметрика

Подробности о метриках

Технологии на основе CRISPR/Cas9 революционизируют способы конструирования микробных клеток. Одним из ключевых преимуществ CRISPR при конструировании штаммов является то, что он обеспечивает интеграцию в хромосомы свободной от маркеров ДНК, устраняя трудоемкие и часто неэффективные процедуры восстановления маркеров. Несмотря на преимущества, сборка систем редактирования CRISPR/Cas9 по-прежнему не является простым процессом, что может помешать его использованию и применению. В этой работе мы выявили некоторые основные ограничения текущих наборов инструментов Cas9 и разработали улучшения с целью упростить доступ к технологиям CRISPR и облегчить их внедрение. К ним относятся 1) система быстрого переключения между безмаркерными и основанными на маркерах интеграционными конструкциями с использованием как Cre-экспрессирующих, так и стандартных штаммов Escherichia coli, 2) возможность перенаправлять мультигенные интеграционные кассеты в альтернативные геномные локусы посредством обмена на основе Golden Gate. гомологических плеч, 3) быстрый и простой метод in vivo сборки направляющих последовательностей РНК посредством рекомбинации между Cas9-хелперными плазмидами и отдельными олигонуклеотидами. Мы объединяем эти методологии с хорошо зарекомендовавшими себя технологиями в комплексный набор инструментов для эффективной метаболической инженерии с использованием CRISPR/Cas9. В качестве доказательства концепции мы разработали набор инструментов YaliCraft для Yarrowia lipolytica, который состоит из базового набора из 147 плазмид и 7 модулей различного назначения. Мы использовали этот набор инструментов для создания и характеристики библиотеки из 137 промоторов, а также для создания штамма de novo, синтезирующего 373,8 мг/л гомогентизиновой кислоты.

Развитие технологий на основе CRISPR/Cas9 позволило быстро, точно и без рубцов проводить геномные модификации, что открывает большой потенциал для создания микробных штаммов и биопроизводства. В частности, метаболическая инженерия дрожжей является одной из наиболее быстро развивающихся областей инженерной биологии, обеспечивающей устойчивое производство химикатов, топлива, материалов, продуктов питания и фармацевтических препаратов1. Несмотря на большой метаболический потенциал эукариотических клеток, благодаря их одноклеточной природе и быстрому росту, дрожжи легче проектировать и культивировать в больших масштабах.

По этой причине системы CRISPR были разработаны для дрожжей2,3,4. Одним из наиболее важных преимуществ CRISPR является то, что благодаря своей высокой эффективности он позволяет осуществлять безмаркерные модификации генома. При традиционной инженерии штаммов удаление селектируемых маркеров из генома, известное как восстановление маркеров, является распространенным узким местом5. Даже быстрорастущим культурам дрожжей требуется не менее пяти дней для восстановления маркеров6, тогда как сама интегративная трансформация занимает всего два или три дня. Таким образом, за последние годы было разработано несколько методов безмаркерной интеграции с помощью CRISPR6,7,8,9. Несмотря на эти разработки, многие текущие проекты метаболической инженерии по-прежнему полагаются на подходы, основанные на маркерах, что может ограничить или задержать успех в оптимизации штаммов. В этой работе мы определили 3 улучшения систем CRISPR/Cas9, которые могут облегчить использование дрожжевой инженерии на основе Cas9: (1) легкая замена маркерных и безмаркерных модификаций (2) быстрая замена гомологичных плеч для различных интеграций. местоположения и (3) простой метод клонирования гРНК.

Во время безмаркерной интеграции на основе CRISPR единственным селективным фактором является двухцепочечный разрыв (DSB), индуцированный Cas9. Для размножения клеткам необходимо восстановить это повреждение. Это может произойти либо с использованием матрицы (донора), которая интегрируется посредством гомологичной рекомбинации (HR), либо с помощью негомологичного соединения концов (NHEJ), т.е. без интеграции. Активность NHEJ наблюдается у большинства видов грибов, включая пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae5,10. У видов, у которых NHEJ является преобладающим механизмом, распространенной стратегией повышения HR является удаление генов NHEJ (KU70, KU80, POL4 и DNL4)11. Эта стратегия, хотя и улучшает HR, не предотвращает полностью нежелательную деятельность NHEJ12. Таким образом, выделение трансформантов с модификациями, приводящими к фенотипам медленного роста, представляет собой общую проблему для подходов безмаркерной интеграции. Это связано с тем, что индел-мутанты, продуцируемые NHEJ, могут разрастаться и маскировать редкие и медленно растущие интегративные трансформанты. Хотя безуспешные инженерные усилия редко публикуются, есть один пример, связанный с нарушением гена SDH5 у Yarrowia lipolytica. Несмотря на многочисленные попытки, эта модификация не была выделена с использованием безмаркерной стратегии на основе CRISPR13, тогда как успешная делеция была получена с использованием ауксотрофного маркера14. Подобные наблюдения широко распространены в работах по дрожжевой инженерии, где часто некоторые локусы модифицировать легче, чем другие, а некоторые остаются безуспешными — отчасти из-за сложности выбора медленно растущих локусов. Такие мутации с вредным воздействием на рост клеток часто встречаются в метаболической инженерии15. Полногеномные исследования S. cerevisiae показали, что сверхэкспрессия 20% генов16 и нарушение 15% несущественных генов17 отрицательно влияют на рост клеток. Кроме того, на жизнеспособность клеток могут отрицательно влиять эпистатические взаимодействия между модификациями неаллельных генов18. Следовательно, инженерные подходы, основанные на безмаркерной интеграции, могут включать случайные (но трудно предсказуемые) случаи, когда необходим строгий отбор на основе ауксотрофного маркера. В этих случаях необходимо будет заново собрать новую кассету, что значительно задержит процесс. Таким образом, желаемым улучшением систем интеграции с использованием CRISPR/Cas9 мог бы стать метод легкого возврата к интеграции на основе маркеров, когда попытка без маркеров терпит неудачу.